更新时间2018-08-30 12:07:59
针对目的细菌(总细菌、类杆菌.普氏杆菌属组、双歧杆菌、肠杆菌科细菌及肠球菌)16s rDNA 的特异性引物及实时定量 PCR 方法,分析 QIAamp粪便 DNA 试剂盒法(QIA 法)、FastDNAKit 试剂盒法(Fast 法)、酚-氯仿-玻璃珠击打法(酚-氯仿-玻珠法)及 QIAampDNA 粪便试剂盒+玻璃珠击打法(QIA+玻珠法)4种方法抽提获得的10份人粪便 DNA 的质与量。结果通用引物特异性扩增粪便总 DNA,发现4/10份由酚-氯仿-玻珠法获得的粪便 DNA 中存在 PCR 抑制剂,过柱纯化后 PCR 抑制现象消失。实时定量 PCR 检测粪便总细菌量,以 QIA 法与 QIA+玻珠法获得的量最高(分别为12.16±0.18,12.05±0.48),而 Fast 法与酚-氯仿-玻珠法获得的粪便细菌量(分别为11.26±0.40,11.21±0.16)与 QIA 法相比显著低下(均 P0.05)。采用 QIA 法(11.63±O.23,8.68±0.51)及 QIA+玻珠法(11.67±0.56,8.77±0.56)抽提获得的粪便类杆菌-普氏杆菌及肠杆菌科细菌的 DNA 量显著高于 Fast 法(10.67±0.47,7.39±0.51)及酚-氯仿-玻珠法(10.65±0.33,7.40±0.18)(均 P0.05)。对于双歧杆菌,酚-氯仿-玻珠法获得的量显著低下。但对肠球菌而言,以 Fast法获得的量最高。结论实时定量 PCR 检测结果表明,QIA 法及 QIA+玻珠法获得的粪便 DNA 质与量总体上优于 Fast 法及酚-氯仿-玻珠法,但根据不同的目的细菌群对象可以选择不同的方法。整个过程很复杂。
提取粪便DNA可以直接用粪便DNA提取试剂盒，使用步骤：
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、称取粪便样本 0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入 450ul 溶液 A 震荡混匀。* 也可直接称取样本 0.1-0.5g 于离心管(建议使用 2ml 圆底管)，加入 450ul 溶液 A 剧烈震荡混匀1-2min 至没有固体块。 使用液氮研磨效果最佳。
2、加入 50ul 溶液 B 充分颠倒混匀( 不要剧烈震荡)，65℃水浴 6min，每 2min 充分颠倒混匀一次。
3、加入 100ul 溶液 C 充分颠倒混匀( 不要剧烈震荡)，12000 rpm 离心 10min 。
4、将上清转移到新的离心管，12000rpm 离心 2min 。
5、在吸附柱中加入 200ul 溶液 D ，将离心后的上清加入到带有溶液 D 的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000 rpm 离心 1min。
6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱( 必须)，12000 rpm 离心 1min。
7、倒掉收集管中的废液，在吸附柱中加入漂洗液 500ul，12000 rpm 离心 1min。
8、倒掉收集管中的废液，重复步骤 7 两次(共漂洗三次)。
9、倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，12000 rpm 离心 2min 。
10、拿出吸附柱在室温干燥数分钟( 因季节及气候等因素不等)，或 50℃干燥 1min。
11、将吸附柱放入一个新的离心管中，加入 50-100ul 洗脱液(65 ℃预热)，12000 rpm 离心 1min。12、将离心管中的液体重新加入到吸附柱中，12000 rpm 离心 1min。离心管中即为粪便微生物 DNA 溶液。
注意事项：
1、新鲜的粪便样本会得到更高的产率，不同样本在采样前应先查阅相应的最佳保存条件。
2、若溶液中出现浑浊可在 37℃水浴中溶解片刻至清澈，不会影响结果。
3、在需要吸取上清液的步骤中应避免吸到沉淀，否则会堵塞吸附柱，并影响产物纯度。
4、洗脱缓冲液的体积最好不少于 50ul ，体积过小会影响回收效率；建议使用试剂盒附带的洗脱缓冲液，用水洗脱也会损失部分产物；DNA 应保存在-20 ℃避免反复冻融，以防降解。
5、 液体试剂避免接触皮肤，若意外接触应立即使用大量清水冲洗。
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