更新时间2018-07-25 13:12:51
在临床样本中，比如鼻咽试子，肺泡灌洗液等，有效的提取微量微生物的核酸
什么是核酸？
由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。
提取核酸的方法及其优缺点？
核酸提取的原则
1.保证核酸一级结构的完整性。
2.排除其它分子的污染。
核酸提取应注意的问题
1.简化步骤，缩短提取时间
2.减少化学因素对核酸的降解
3.减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温
4.防止核酸的生物降解
核酸提取大致分为3大部分：破碎、提取、纯化
细胞裂解方法
1.物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、匀浆法
2.化学方式：表面活性剂（SDS法）、碱裂解法
3.生物方式：酶法（溶菌酶、蛋白酶K等）
常见样本提取方法总结
浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
吸附材料结合法：1.硅质材料 高盐低PH值结合核酸，低盐高PH值洗脱
2.阴离子交换树脂 低盐高PH值结合核酸，高盐低PH值洗脱
3.磁珠 磁珠微粒包裹上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分离的目的
核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质
DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。
说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8
1.胍盐提取结合二氧化硅吸附法二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。2.TRIzol试剂提取RNA方法：
TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。3.离心柱提取旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分：利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。5.磁珠法
依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
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