细菌、病毒的感染力测定有哪些方法

更新时间2018-03-16 18:26:46

病毒感染力的滴定（TCID50的测定） 一般都是滴定测定

概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的 

 

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法 

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料 

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤 

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。 

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。 

3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。 4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液） 

5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法 五、TCID50的计算方法 1、Reed-Muench两氏法 

病毒液稀释度 

出现CPE孔

数 

无CPE孔数 

累计 

出现CPE孔所占的% 

CPE孔数 

无CPE孔数 10-1

 8 0 27 0 100（27/27） 10-2

 8 0 19 0 100（19/19） 10-3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10-4 3 5 4 6 40（4/10） 10-5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10-6 

0 

8 

0 

21 

0（0/21） 

CPE：Cytopathic effect 

距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8 

lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 

TCID50=10-3.8/0.1ml 

含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。 2、Karber法 

病毒液稀释度 出现CPE的孔数 出现CPE孔的比率 10-1 8 8/8=1 10-2 

8 

8/8=1 

 

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10-3 7 7/8=0.875 10-4 3 3/8=0.375 10-5 1 1/8=0.125 10-6 

0 

0/8=0 

lgTCID50=L-d(s-0.5) L：最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 

TCID50=10-3.875/0.1ml 

含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。  

实例1鸡新城疫活疫苗 

（一）培养病毒  将鸡新城疫病毒（la sota株）接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。 （二）检测尿囊液病毒的EID50 

1．EID50的概念  EID50为半数鸡胚感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后，能使半数鸡胚发生感染的病毒量。 2．病毒EID50的测定 

（1）稀释病毒  将收获的尿囊液充分混匀后取1ml，作10倍递进稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀释度。 （2）接种鸡胚  每个稀释度接种9～11d SPF鸡胚5枚，接种量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，逐日观察至120h，其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏，至第5d时将所有的鸡胚置4℃冰箱中冷却4h或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别存放。 

（3）检测血凝价，判断感染情况  用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价，当HA≥1:128时判为感染。